Les plantes carnivores forment une classe à part parmi les Angiospermes, elles se situent à la frontière de l'autotrophie végétale. Elles se sont adaptées à des milieux pauvres en nutriments en développant des organes spécialisés dans l'entomophagie qui leur permettent  de pallier aux carences nutritives, notamment azotées. Ces organes sont le siège de flux complexes impliqués autant dans l'attraction des insectes que dans leur digestion et enfin dans la distribution des nutriments au reste de la plante. Quels sont ces flux ? Impliquent-ils des populations cellulaires particulières ?

    Pour la capture d'insectes la plante est pourvue de différents atouts : des couleurs vives, un nectar sucré contenant des drogues et un piège dont la surface ne présente aucune aspérité susceptible d'aider l'insecte dans sa fuite.

        L'observation directe du piège permet donc de mettre en évidence la sécrétion d'une substance visqueuse, sirupeuse sous l'opercule au niveau de petites ornementations circulaires plus foncées que le reste de la surface de l'opercule. Cette substance peut être du nectar ou bien du mucilage comme on peut en trouver sur les feuilles de Drosera servant à la capture ou alors peut avoir une fonction de protection.

1er test : test des sucres réducteurs à la liqueur de Fehling ;  pour réaliser ce test on récupère un peu de nectar à l'aide d'un petit morceau de gaze que l'on met en présence de la liqueur de Fehling dans un tube à essai, on obtient après chauffage un beau précipité rouge brique. Le test est donc positif.
Cette substance est un nectar ; contient-il, comme chez Sarracenia, des drogues paralysant les insectes ?

2ème test : un alcaloïde nommé coniine est présent dans le nectar de Sarracenia. Quelques nanogrammes suffisent à paralyser une fourmi et seule la forme S de la molécule est active.  Vérifions la présence de telles substances chez Nepenthes. Pour ceci, nous avons usé du test des amines II, par la réaction de diazotation

    Le dérivé diazoïque constitue une phase liquide non miscible avec le reste des réactifs ou une phase solide (un précipité).
Nous avons effectué ce test sur le nectar et il s'est avéré positif; le tube à essai de gauche présente un ménisque plus large que le témoin de droite, correspondant à la présence d'une phase supplémentaire de faible densité.

 
 l'alcaloïde nommé coniine

    L'insecte, drogué par les substances du nectar tombe dans l'urne et n'arrive pas à remonter sur la paroi lisse. De plus, chez quelques espèces de Nepenthes, des poils dirigés vers le bas sont présents sous l'opercule, gênant également la remontée de l'insecte.

Conclusion : un premier flux sortant a été mis en évidence. Les cellules glandulaires sous operculaires et pariétales du péristome sécrètent du nectar qui attire les insectes et les drogue, leur capture s'en trouve ainsi facilitée.

    Lorsqu'on met un morceau de viande dans une urne fraîche de Nepenthes, celui-ci est dégradé en moins d'une semaine : l'urne étant jeune, elle contient encore peu de bactéries, donc la dégradation est due à la nature du liquide de l'urne. Il contient donc sans doute de nombreux enzymes, notamment protéolytiques.
Notons que ce suc digestif est soumis à des contraintes, les enzymes  ayant des activités dépendant de la température, et celle-ci varie au cours de la journée en milieu naturel. Par ailleurs, la digestion se fait en milieu externe et les enzymes risquent d'être oxydés. L'activité enzymatique doit donc être adaptée.

B/ structure à l'origine du suc enzymatique digestif : observation de complexes glandulaires

    L'urne de Nepenthes naît à l'extrémité d'une vrille qui est en fait le prolongement de la nervure centrale de la feuille. Lorsqu'elle est mûre la bordure operculaire se déchire, l'opercule se soulève et l'on peut  voir au fond de l'urne un peu de liquide.

1er test : test du Biuret
Une coloration violette apparaît au bout de quelques instant, ce liquide contient des protéines.

2ème test : mise en évidence d'une activité enzymatique
Le but de la manipulation est une approche qualitative de la nature du suc à travers la mise en évidence d'un profil de digestion de la protéine ovalbumine.
 L'électrophorèse est une technique basée sur la migration différentielle de molécules chargées sur un gel mis sous tension. La migration des molécules, généralement chargées négativement, s'effectue de l'anode à la cathode et est fonction du poids et de la charge de la molécule. Cette technique permet donc un tri sélectif des molécules présentes dans l'échantillon testé.

Nous avons réalisé les électrophorèses de témoins "ovalbumine pure", "suc digestif pur" et du mélange suc de l'urne 5mL + 1mL d'ovalbumine à différents temps.
Par la comparaison des différentes électrophorèses, nous pouvons repérer les protéines issues de la digestion et donc tracer un profil de digestion.
Les résultats obtenus nous permettent de caractériser de manière qualitative la vitesse de digestion  de Nepenthes. L'albumine est effectivement clivée au cours du temps, le suc sécrété par l'urne est bien un suc digestif. On peut étendre ce résultat à l'ensemble des nutriments libérés par la digestion.

3ème test : mise en évidence de protéases (déjà entamée au 2ème test)

Ci-dessus, aspect des films après une semaine où ils ont barboté dans les tubes à essai : à droite notre témoin (eau distillée), à gauche le test gélatinase positif  réalisé avec le suc

    Nous avons également testé la présence d'une activité amylasique mais ce test s'est révélé négatif. Par contre, une activité catalase a pu être mise en évidence : pour cela, nous avons mis en présence du suc et du peroxyde d'hydrogène, et nous avons observé la formation de complexes à forte activité et d'où se dégageaient de nombreuses bulles d'O2.

Aspect d'un complexe catalase à différents temps : t=0 ; t=3 min. ; t=10 min.

    Cette expérience a été répétée à partir de suc d'urne juvénile et puis de suc d'une urne âgée dans laquelle on avait placé un morceau de viande. Dans le premier cas, le test s'est révélé négatif, ce qui semble nier la production de la peroxydase par les glandes digestives. Dans le second cas, le test est positif.
Il y a alors plusieurs hypothèses :
-    la catalase provient des muscles (c'est-à-dire de la viande), mais ceux-ci étant âgés de 4 mois, au moment du deuxième test, il est peu probable que ces enzymes étaient encore  fonctionnelles.
-    La catalase provient d'une activité bactérienne, essentielle chez d'autres types de plantes carnivores, tel Heliamphora
.    La catalase est produite par la plante suite à une stimulation protéique.
Expérience complémentaire : Un morceau de viande bouillie a été placé dans une urne, contrôlée positive au test catalase, stérilisée à l'eau de Javel puis hermétiquement fermée grâce à une pince de Mohr ; quatre jours plus tard, le test du suc de l'urne s'est révélé positif à la catalase.
Ainsi, la catalase semble bien être produite par la plante et non par une activité bactérienne. La détection de catalase est intéressante, dans la mesure ou H2O2 aide au clivage des macromolécules.

D'après Amagase et Tokès, le liquide de l'urne contient aussi des chitinases, ce qui est tout à fait compatible avec l'activité entomophage caractéristique de Nepenthes.
Après plusieurs déterminations de  pH, nous avons constaté que le liquide de l'urne apparaît comme un milieu tamponné. Nos tests de pH réalisés dans une urne fonctionnelle ont révélé un pH=3. Nos données bibliographiques nous apprennent de plus que l'activité enzymatique se fait de façon optimale à pH=3
De plus, outre les enzymes protéolytiques, la plante secrète aussi des acides organiques et des ions Na+ et Cl-, ainsi que de l'eau.

Conclusion : un second flux de matière a été mis en évidence. En effet, des cellules glandulaires de l'urne sécrètent un liquide contenant des enzymes capables de cliver des protéines, des glycoprotéines, des lipides, des acides nucléiques. Comme les enzymes sont nécessaires en faible quantité, la différence en masse des flux dus à la sécrétion d'enzymes et l'absorption de nutriments permet un gain en masse.

    Afin de mettre en évidence les flux entrants au niveau de l'urne nous avons utilisé un marqueur fluorescent : la fluorescéine(en espérant que celle-ci ne sera pas considérée comme un déchet pour la plante). La fluorescéine a en effet la propriété d'émettre des radiations vertes fluo lorsqu'elle est éclairée par des UV. Cette substance est donc particulièrement intéressante pour suivre les mouvements de fluides à l'intérieur des tissus.
Quelques gouttes de fluorescéine ont été ainsi versées dans une urne située au bas de  la plante. Après trois jours, des coupes fines ont été réalisées à la main au niveau de l'urne, de la feuille et d'une urne juvénile en cours de croissance située à l'apex de la plante. A l'aide d'un microscope équipé de lampes UV, nous avons pu observer de la fluorescéine dans les complexes glandulaires(ci-contre) de l'urne mais également dans les tubes phloémiens situés en arrière des complexes et dans les FCV de plus grande taille.
La fluorescéine a imprégné les glandes qui semblent donc impliquées dans l'absorption nutritive. De plus, seule une fraction des cellules de la glande est fluorescente (non visible sur cette photo), ce qui nous permet de localiser les cellules potentiellement impliquées dans l'absorption et celles spécialisées dans la sécrétion (contenu cytoplasmique dense aux électrons : cf. structure de la glande).

    La  fluorescéine est également passée dans les tissus conducteurs ; on la retrouve dans les glandes nectarifères de l'opercule.
Dans la feuille, elle  marque le FCV central sous forme d'une traînée discontinue(irrégularité de la coupe). Enfin, la substance fluo a été repérée dans l'urne juvénile au niveau des zones de croissance tissulaire le long d'un cercle et dans des poils orientés vers l'intérieur de l'urne.

Remerciements à l'association Rossolis pour le prêt de plantes.
Remerciements à Monsieur RAUL  et son équipe du laboratoire de contrôle métabolique et nutritionnel de l'Université Louis Pasteur de Strasbourg.
Plantes Carnivores, Marcel LECOUFLE, édition Bordas.
Suppléments n° 3 , 2001, " du côté de la recherche  " , p.13, Association Dionée.
Botanical society of America : http://www.amjbot.org/cgi/content/full/86/10/1382
Annales de biologie : http://www.john-libbery-eurotext.fr/articles/abc/59/6/764-5/