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Scientifique: Séance essais de micrographies 2006
Transmis par jessclub le 30 July 2006 à 00:00:00 CEST
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Le mois dernier Clément nous a invité chez lui pour une séance de micrographie optique. Le microscope et l'appareil photo de ses parents offrent des possibilités prometteuses...Dionaea, drosera, utricularia, pinguicula sont passés sous l'objectif après un passage sous le scalpel!




Gérald et Lionel réalisent des préparations sur lames et lamelles. Les coupes doivent être les plus fines possibles pour permettre l'observation des tissus.




Clément réalise méticuleusement une coupe.



Nos travailleurs de force à l'oeuvre !



Clément nous expose le détail d'une préparation. Des scalpels aux lames bien tranchantes sont nécessaires pour couper de manière nette des tissus relativement fragiles qui déchirent assez facilement. Une fois le tissu coupé, Clément le place sur la lame dans une goutte d'eau afin qu'il ne sèche pas. Il le recouvre ensuite d'une lamelle de verre.



Et voilà, la préparation est prête ! La mise au point n'est pas facile à faire, il faut jouer avec les différentes molettes et le diaphragme.

   

Ca y est ! Vous reconnaissez ? C'est un utricule de Utricularia livida avec sa vacuole renfermant une grande bulle d'air. Vous remarquerez les cils sensitifs au niveau du péristome (la bouche) de l'utricule. A droite, vous reconnaîtrez les glandes digestives en forme d'étoiles.





Et ceci, ça vous dit quelque chose? Ce sont des cils glanduleux de drosera et pas n'importe lequel ! c'est un Drosera paradoxa ! Vous remarquerez la striation centrale des cils qui est en fait du FCV (faisceau criblo vasculaire), tissus cellulaires impliqués dans le transport de la sève.



Le xylème est particulièrement visible au centre de cil.





La glande responsable de la sécrétion muscilagineuse est bien visible au centre des cils



Lionel nous prépare une coupe de feuille de Pinguicula x weser



Encore quelques minutes pour la mise au point et nous y serons presque



Et voilà ! Intéressante cette photo, non ? Vous retrouvez sur la face interne de la feuille les cils glanduleux de pinguicula qui sont sensiblement différents de ceux de drosera. Au centre de la coupe, les "massifs" sombres sont des FCV, tissus permettant la circulation de la sève. De part et d'autre, du parenchyme polyédrique de remplissage constitue l'essentiel du volume de la feuille. Cette population cellulaire s'applique à réaliser  la photosynthèse.



Le cil de pinguicula est visiblement constitué d'une cellule unique surmontée d'un groupe cellulaire constituant le pédoncule.



Ensemble de cils de pinguicula à un faible grocissement







Gros plan de cils de pinguicula



Cils de pinguicula sur leur support



Lionel réalise une préparation d'étamine de Drosera paradoxa





L'étamine a un aspect plumeux. Quatre grains de pollen de couleur foncée subsistent (bas de la photo).



Agrandissement d'un grain de pollen



Une multitude de chloroplastes (petits grains verts) se meuvent au sein du parenchyme palissadique de feuille de dionée ( Dionaea muscipula ). Sur la face interne, vous reconnaîtrez des glandes digestives sous la forme de petites sphères granuleuses.





Clément observe une préparation de poil sensitif de dionée



Poil sensitif de dionée



Base d'un poil sensitif de dionée



Microscope et matériel de coupe: Clément Bauer, Photos: Gérald Bach  Texte: Gérald Bach  et Lionel Léopoldès toute reproduction interdite sans l'accord des auteurs


(Suite... | Score: 5)
5333 lecture(s)
Scientifique: Structure cellulaire des urnes de nepenthes
Transmis par jessclub le 15 October 2005 à 00:00:00 CEST
Nepenthes

INTRODUCTION :

    Les plantes carnivores forment une classe à part parmi les Angiospermes, elles se situent à la frontière de l'autotrophie végétale. Elles se sont adaptées à des milieux pauvres en nutriments en développant des organes spécialisés dans l'entomophagie qui leur permettent  de pallier aux carences nutritives, notamment azotées. Ces organes sont le siège de flux complexes impliqués autant dans l'attraction des insectes que dans leur digestion et enfin dans la distribution des nutriments au reste de la plante. Quels sont ces flux ? Impliquent-ils des populations cellulaires particulières ?


Plan de l'étude


I.    Appât et capture : orientation d'un flux de proies


A/Description du piège chez Nepenthes
B/structure à l'origine de la sécrétion : observation de complexes glandulaires
C/Analyse chimique de la sécrétion operculaire
D/Capture

II.    Digestion en milieu externe : amorce d'un flux de nutriments

A/sécrétion d'un suc digestif efficace
B/structure à l'origine du suc enzymatique digestif : observation de complexes glandulaires
C/Mise en évidence d'une activité enzymatique dans le liquide de l'urne de Nepenthes

III.    Nutrition : flux de nutriments dans la plante

A/absorption des produits de digestion au niveau des glandes
B/transport des nutriments dans toute la plante

Conclusion

Bibliographie




I. Appât et capture:


A/ Description du piège

    Pour la capture d'insectes la plante est pourvue de différents atouts : des couleurs vives, un nectar sucré contenant des drogues et un piège dont la surface ne présente aucune aspérité susceptible d'aider l'insecte dans sa fuite.

Zone d'attraction

Sous l'opercule se trouvent de nombreuses glandes dont la sécrétion est retenue au niveau des rebords dentés du péristome. Celui-ci absorbe les U.V. et donc joue un rôle important dans l'attraction à distance des insectes.


Zone de conduction

Lorsqu'un insecte s'introduit dans l'urne afin d'accéder au nectar, il est piégé par la courbure du péristome et chute au fond de l'urne, qui contient un liquide. Il est alors enduit d'une fine pellicule de liquide qui empêche son adhésion à la zone cireuse et donc sa sortie de l'urne.


Zone digestive

D'épuisement, il meurt et coule au fond du liquide secrété par les nombreuses glandes digestives ( 1200 par cm2 ) du tiers inférieur de l'urne.


        L'observation directe du piège permet donc de mettre en évidence la sécrétion d'une substance visqueuse, sirupeuse sous l'opercule au niveau de petites ornementations circulaires plus foncées que le reste de la surface de l'opercule. Cette substance peut être du nectar ou bien du mucilage comme on peut en trouver sur les feuilles de Drosera servant à la capture ou alors peut avoir une fonction de protection.


B/ structure à l'origine du nectar : observation de complexes glandulaires (*50)


épiderme de revêtement
localement absent au niveau d'une ...




glande nectarifère,
qui est à proximité immédiate d'un ...


faisceau cribro-vasculaire vue en coupe longitudinale apportant les sucres des réserves foliaires

L'approvisionnement en sucre se fait à partir des abondantes réserves amylacées de la feuille via les tubes phloémiens.

®Ci-contre, coupe transversale de feuille colorée au lugol. (*50)


C/ Analyse chimique de la sécrétion operculaire


1er test : test des sucres réducteurs à la liqueur de Fehling ;  pour réaliser ce test on récupère un peu de nectar à l'aide d'un petit morceau de gaze que l'on met en présence de la liqueur de Fehling dans un tube à essai, on obtient après chauffage un beau précipité rouge brique. Le test est donc positif.
Cette substance est un nectar ; contient-il, comme chez Sarracenia, des drogues paralysant les insectes ?

2ème test : un alcaloïde nommé coniine est présent dans le nectar de Sarracenia. Quelques nanogrammes suffisent à paralyser une fourmi et seule la forme S de la molécule est active.  Vérifions la présence de telles substances chez Nepenthes. Pour ceci, nous avons usé du test des amines II, par la réaction de diazotation

H3O+, Cl-
        R-NH-R' + (Na+,NO2-)     - donne-         R,R'-N-N=O + (Na+,Cl-,...)
À 0°C

    Le dérivé diazoïque constitue une phase liquide non miscible avec le reste des réactifs ou une phase solide (un précipité).
Nous avons effectué ce test sur le nectar et il s'est avéré positif; le tube à essai de gauche présente un ménisque plus large que le témoin de droite, correspondant à la présence d'une phase supplémentaire de faible densité.

 
 l'alcaloïde nommé coniine


             
    


D/capture :

    L'insecte, drogué par les substances du nectar tombe dans l'urne et n'arrive pas à remonter sur la paroi lisse. De plus, chez quelques espèces de Nepenthes, des poils dirigés vers le bas sont présents sous l'opercule, gênant également la remontée de l'insecte.

Conclusion : un premier flux sortant a été mis en évidence. Les cellules glandulaires sous operculaires et pariétales du péristome sécrètent du nectar qui attire les insectes et les drogue, leur capture s'en trouve ainsi facilitée.


II. Digestion en milieu externe


A/sécrétion d'un suc digestif efficace


    Lorsqu'on met un morceau de viande dans une urne fraîche de Nepenthes, celui-ci est dégradé en moins d'une semaine : l'urne étant jeune, elle contient encore peu de bactéries, donc la dégradation est due à la nature du liquide de l'urne. Il contient donc sans doute de nombreux enzymes, notamment protéolytiques.
Notons que ce suc digestif est soumis à des contraintes, les enzymes  ayant des activités dépendant de la température, et celle-ci varie au cours de la journée en milieu naturel. Par ailleurs, la digestion se fait en milieu externe et les enzymes risquent d'être oxydés. L'activité enzymatique doit donc être adaptée.

B/ structure à l'origine du suc enzymatique digestif : observation de complexes glandulaires


du parenchyme polyédrique volumineux de remplissage autour d'une ...



glande digestive pluricellulaire surmontée d'une ...

assise épidermique de revêtement

®détail du bord de l'urne (*120)


parenchyme polyédrique

faisceau cribro-vasculaire en coupe longitudinale, à proximité immédiate du

complexe glandulaire


épiderme de revêtement

®coupe transversale de la paroi de l'urne (*50)


Les glandes digestives sont composées de trois types cellulaires au-dessus d'une dépression  de cellules en continuité avec l'épiderme. La couche la plus externe contient 40 à 60 petites cellules en colonnes suivies immédiatement de 16 cellules rectangulaires au cytoplasme dense aux électrons. La troisième couche cellulaire de la glande comprend 8 à 12 cellules cubiques qui reposent sur de petites cellules vacuolisées. La base de la glande semble être directement reliée avec…
…des éléments trachéens.(*120)



C/ Mise en évidence d'une activité enzymatique dans le liquide de l'urne de Nepenthes :

    L'urne de Nepenthes naît à l'extrémité d'une vrille qui est en fait le prolongement de la nervure centrale de la feuille. Lorsqu'elle est mûre la bordure operculaire se déchire, l'opercule se soulève et l'on peut  voir au fond de l'urne un peu de liquide.


1er test : test du Biuret
Une coloration violette apparaît au bout de quelques instant, ce liquide contient des protéines.

2ème test : mise en évidence d'une activité enzymatique
Le but de la manipulation est une approche qualitative de la nature du suc à travers la mise en évidence d'un profil de digestion de la protéine ovalbumine.
 L'électrophorèse est une technique basée sur la migration différentielle de molécules chargées sur un gel mis sous tension. La migration des molécules, généralement chargées négativement, s'effectue de l'anode à la cathode et est fonction du poids et de la charge de la molécule. Cette technique permet donc un tri sélectif des molécules présentes dans l'échantillon testé.

Nous avons réalisé les électrophorèses de témoins "ovalbumine pure", "suc digestif pur" et du mélange suc de l'urne 5mL + 1mL d'ovalbumine à différents temps.
Par la comparaison des différentes électrophorèses, nous pouvons repérer les protéines issues de la digestion et donc tracer un profil de digestion.
Les résultats obtenus nous permettent de caractériser de manière qualitative la vitesse de digestion  de Nepenthes. L'albumine est effectivement clivée au cours du temps, le suc sécrété par l'urne est bien un suc digestif. On peut étendre ce résultat à l'ensemble des nutriments libérés par la digestion.

3ème test : mise en évidence de protéases (déjà entamée au 2ème test)

Un test simple consiste à mettre en présence quelques millilitres de liquide de l'urne et un morceau de film photo et on laisse agir cinq jours. Le film photo témoin qui barbotait dans de l'eau distillée n'a pas bougé tandis que celui mis en présence du liquide de l'urne ne possède plus de gélatine et les grains d'argent ont été libérés dans la solution. Le liquide de l'urne semble contenir des protéases notamment une gélatinase.

Ci-dessus, aspect des films après une semaine où ils ont barboté dans les tubes à essai : à droite notre témoin (eau distillée), à gauche le test gélatinase positif  réalisé avec le suc

    Nous avons également testé la présence d'une activité amylasique mais ce test s'est révélé négatif. Par contre, une activité catalase a pu être mise en évidence : pour cela, nous avons mis en présence du suc et du peroxyde d'hydrogène, et nous avons observé la formation de complexes à forte activité et d'où se dégageaient de nombreuses bulles d'O2.



Aspect d'un complexe catalase à différents temps : t=0 ; t=3 min. ; t=10 min.

    Cette expérience a été répétée à partir de suc d'urne juvénile et puis de suc d'une urne âgée dans laquelle on avait placé un morceau de viande. Dans le premier cas, le test s'est révélé négatif, ce qui semble nier la production de la peroxydase par les glandes digestives. Dans le second cas, le test est positif.
Il y a alors plusieurs hypothèses :
-    la catalase provient des muscles (c'est-à-dire de la viande), mais ceux-ci étant âgés de 4 mois, au moment du deuxième test, il est peu probable que ces enzymes étaient encore  fonctionnelles.
-    La catalase provient d'une activité bactérienne, essentielle chez d'autres types de plantes carnivores, tel Heliamphora
.    La catalase est produite par la plante suite à une stimulation protéique.
Expérience complémentaire : Un morceau de viande bouillie a été placé dans une urne, contrôlée positive au test catalase, stérilisée à l'eau de Javel puis hermétiquement fermée grâce à une pince de Mohr ; quatre jours plus tard, le test du suc de l'urne s'est révélé positif à la catalase.
Ainsi, la catalase semble bien être produite par la plante et non par une activité bactérienne. La détection de catalase est intéressante, dans la mesure ou H2O2 aide au clivage des macromolécules.

D'après Amagase et Tokès, le liquide de l'urne contient aussi des chitinases, ce qui est tout à fait compatible avec l'activité entomophage caractéristique de Nepenthes.
Après plusieurs déterminations de  pH, nous avons constaté que le liquide de l'urne apparaît comme un milieu tamponné. Nos tests de pH réalisés dans une urne fonctionnelle ont révélé un pH=3. Nos données bibliographiques nous apprennent de plus que l'activité enzymatique se fait de façon optimale à pH=3
De plus, outre les enzymes protéolytiques, la plante secrète aussi des acides organiques et des ions Na+ et Cl-, ainsi que de l'eau.

Conclusion : un second flux de matière a été mis en évidence. En effet, des cellules glandulaires de l'urne sécrètent un liquide contenant des enzymes capables de cliver des protéines, des glycoprotéines, des lipides, des acides nucléiques. Comme les enzymes sont nécessaires en faible quantité, la différence en masse des flux dus à la sécrétion d'enzymes et l'absorption de nutriments permet un gain en masse.

III.    Nutrition


A/Absorption des produits de digestion au niveau des glandes


    Afin de mettre en évidence les flux entrants au niveau de l'urne nous avons utilisé un marqueur fluorescent : la fluorescéine(en espérant que celle-ci ne sera pas considérée comme un déchet pour la plante). La fluorescéine a en effet la propriété d'émettre des radiations vertes fluo lorsqu'elle est éclairée par des UV. Cette substance est donc particulièrement intéressante pour suivre les mouvements de fluides à l'intérieur des tissus.
Quelques gouttes de fluorescéine ont été ainsi versées dans une urne située au bas de  la plante. Après trois jours, des coupes fines ont été réalisées à la main au niveau de l'urne, de la feuille et d'une urne juvénile en cours de croissance située à l'apex de la plante. A l'aide d'un microscope équipé de lampes UV, nous avons pu observer de la fluorescéine dans les complexes glandulaires(ci-contre) de l'urne mais également dans les tubes phloémiens situés en arrière des complexes et dans les FCV de plus grande taille.
La fluorescéine a imprégné les glandes qui semblent donc impliquées dans l'absorption nutritive. De plus, seule une fraction des cellules de la glande est fluorescente (non visible sur cette photo), ce qui nous permet de localiser les cellules potentiellement impliquées dans l'absorption et celles spécialisées dans la sécrétion (contenu cytoplasmique dense aux électrons : cf. structure de la glande).


 ® coupe transversale d'urne adulte traitée à la fluorescéine.


B/ Transport des nutriments dans toute le plante


    La  fluorescéine est également passée dans les tissus conducteurs ; on la retrouve dans les glandes nectarifères de l'opercule.
Dans la feuille, elle  marque le FCV central sous forme d'une traînée discontinue(irrégularité de la coupe). Enfin, la substance fluo a été repérée dans l'urne juvénile au niveau des zones de croissance tissulaire le long d'un cercle et dans des poils orientés vers l'intérieur de l'urne.

® coupe transversale d'urne juvénile


    La fluorescéine a donc circulé dans toute la plante en moins de trois jours et de façon importante dans les régions nécessiteuses en nutriments. Le liquide de l'urne n'est donc pas une simple sécrétion tel un nectar, il est en fait le siège de flux bidirectionnels traversant la plante ; outre la sécrétion d'un suc, les glandes sont chargées de la réabsorption de différents nutriments libérés lors de la digestion d'insectes.


Conclusion

    Nos expériences nous ont donc permis de comprendre la dynamique des flux qui s'effectuent au niveau de l'urne de Nepenthes. En effet, ces échanges bidirectionnels entre la plante et son milieu sont réalisés au travers de différentes structures cellulaires intégrées au sein de l'urne. Les flux entrants et sortants ont une localisation spatiale mais également temporelle : d'abord, dans l'urne juvénile, la plante sécrète un bain digestif fait d'enzymes d'ions et d'eau. Puis, dès l'ouverture de l'urne, une sécrétion de nectar s'ajoute aux effets attracteurs visuels de l'urne. Une fois  les proies capturées et digérées, les nutriments sont réabsorbés au niveau de l'urne et distribués dans toute la plante.

Bibliographie


Remerciements à l'association Rossolis pour le prêt de plantes.
Remerciements à Monsieur RAUL  et son équipe du laboratoire de contrôle métabolique et nutritionnel de l'Université Louis Pasteur de Strasbourg.
Plantes Carnivores, Marcel LECOUFLE, édition Bordas.
Suppléments n° 3 , 2001, " du côté de la recherche  " , p.13, Association Dionée.
Botanical society of America : http://www.amjbot.org/cgi/content/full/86/10/1382
Annales de biologie : http://www.john-libbery-eurotext.fr/articles/abc/59/6/764-5/


Texte et photos: Lionel Léopoldès, toute reproduction interdite sans l'accord de l'auteur


(Suite... | Score: 4.45)
12551 lecture(s)
Scientifique: La culture in vitro chez l'amateur
Transmis par lionel le 15 October 2005 à 00:00:00 CEST
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La culture in vitro chez l’amateur

Qu’est ce que la culture in vitro ? Comment procéder ? Quels tissus  utiliser ?

Telles sont les questions que mes amis et moi-même avons soulevées lors de nos premiers essais . Les livres de plantes carnivores, que l’on trouve dans le commerce, négligent ce type de méthode, bien souvent ils se contentent de mentionner les plantes susceptibles de donner de bons résultats en bouteilles. Les expériences dont je vais vous parler ont été réalisées sur des espèces appartenant à des genres différents : drosera, byblis, cephalotus, pinguicula,dionaea et plantes sensitives.

Tout d’abord quels sont les avantages à utiliser ce type de culture ?

-  si la désinfection des milieux a été faite le cultivateur ne verra jamais ses tissus nécroser du fait d’une attaque fongique, virale…

 

- les boutures ou graines pourront profiter d’une atmosphère où règne une humidité proche de 100 %.

 

- ces derniers se développeront sur des milieux riches en vitamines , en hormones de croissances, en antibiotiques, en sels minéraux…

- les milieux contenant des substances mutagènes, le cultivateur pourra espérer obtenir des mutations intéressantes, par exemple, au niveau du piège sur une dionée.

 

- la croissance des plantules est plus rapide (j’ai pu observer des différences en 12h).

 

- on peut mettre en bouteilles des plantes poussant sur tourbe qui ont été jugées trop faibles pour les faire croître et acquérir un peu plus de vigueur.

 

On pourrait trouver d’autres raisons mais celles-ci dépendront des attentes de chacun.

Les tissus et graines utilisés :

Je vais vous parler de celles que mon ami Laurent et moi-même avons testées.

 

Nous avons mis  dans 19 bouteilles du Drosera binata (des crosses), du Drosera capensis feuilles larges (en graines), du Drosera capensis ordinaires (en feuilles), du drosera burmanii géant et fleur rose (en graines), du Drosera enodes (des feuilles), du Byblis liniflora et gigantea (en graines), du Pinguicula caudata (des jeunes feuilles en formation), du weiser (des feuilles), du Biophytum sensitivum (en graines), de la dionée verte, de l’akai ryu et de la dionée normale (des feuilles).

Le procédé :

La préparation des bouteilles est la première opération. Nettoyez tout d’abord les bouteilles à l’eau chaude et au savon (elles doivent être parfaitement propres, la moindre saleté ruinerait vos chances).Vous introduirez ensuite du coton dans les trous ( il faut absolument acheter des bouchons percés)  des bouchons prévus à cet effet (ceci à l’aide d’un fil métallique plié en deux faisant office d’aiguille) il n’est pas nécessaire de remplir ces orifices entièrement. Puis vous préparerez des capsules de bouchon de champagne que vous fixerez sur les bouchons des bouteilles. Ces capsules de sûreté sont souvent utiles dans la mesure où elles retiennent les bouchons de caoutchouc ( ou de silicone) quand vous sortez les bouteilles de la cocotte  minute après la stérilisation. En effet pendant cette opération, l’air présent dans les bouteilles se dilate et entraînerait, sans sûreté, l’expulsion des bouchons. Les bouteilles fermées, vous les mettrez dans la cocotte minute avec un peu d’eau, vous fermerez cette dernière et vous laisserez stériliser un quart d’heure. C’est la stérilisation à vide.

 

 

 

Nous arrivons à présent à la phase deux.

La préparation de la gélose est l’opération la plus simple. Quand vous commandez des milieux in vitro vous pouvez les recevoir sous forme de poudre qu’il faudra chauffer avec de l’eau. Prenons un exemple :  pour une dose de 250 mL,  faites chauffez celle-ci dans 250 mL d’ eau déminéralisée(et stérilisée) au bain-marie sans faire bouillir le mélange. Ce chauffage est nécessaire pour casser le complexe. La poudre dissoute,  versez la solution dans les flacons dans lesquels vous placerez les tissus par la suite.

Les bouteilles prêtes (gélose et capsules de sûreté en place), vous stériliserez ces dernières 20 min dans la cocotte minute. C’est au moment où le sifflet se met en marche que l’on met le chronomètre en route ; ne dépassez pas cette durée pour ne pas détruire les éléments les plus fragiles présents dans la gélose comme les vitamines.

Notons quil ne faut pas que les bouteilles trempent dans l’eau ; si c’était le cas la gélose rentrerait en ébullition et les substances dont nous avons déjà parlées seraient détruites.

 

 

 

Nous arrivons à la phase trois.

Après avoir laissé reposer et gélifier les milieux, vous pourrez mettre les tissus et graines en place.

Le choix des graines et des tissus :

Les graines les plus simples à mettre en bouteilles sont celles de la taille du Byblis liniflora (1 mm). Celles de taille proche du Drosera capensis ne présentent pas plus de difficulté ; par contre les graines de grosseur égale à celles du Drosera burmanii ( 0.3 mm) quelque ne sont pas aisées à mettre en bouteilles. En effet, il est difficile de laver ces graines dans les trois solutions (dont nous parlerons plus tard) parce qu’elles coulent et il est difficile de les récupérer. Je vous conseillerais donc de vous abstenir de travailler avec ce calibre.

En ce qui concerne les feuilles, le choix de parties jeunes, en pleine formation semble être le plus judicieux dans la mesure où ces parties connaissent le plus de divisions cellulaires. Si vous voulez bouturer des feuilles de Drosera binata par exemple vous pourrez utiliser les crosses qui ne sont pas encore déroulées ; de même, pour le Drosera capensis ou rotundifolia vous utiliserez les feuilles encore repliées.

Si vous êtes en présence de feuilles de grande taille, vous couperez des morceaux d’un centimètre carré au niveau de la nervure principale de la feuille. Des morceaux de taille inférieure risqueraient de ne pas être viables.

Certains cultivateurs placent, les plantes destinées à la reproduction en in vitro, dans des endroits protégés des moisissures et autres pestes ( lieux plus ou moin stériles) pour augmenter leurs chances de réussite avec les boutures. Ces lieux peuvent être obtenus par filtration de l’air, désinfection à l’aide de gaz…

La mise en place des graines et des tissus :

Phase 1 : préparez votre plan de travail :

- disposez du papier absorbant imbibé d’eau de javel sur votre table.

- désinfectez les outils (ex : scalpel, pince à épiler, pipette,…) à l’aide d’alcool à 90° et disposez au centre de votre plan de travail un bec bunsen qui vous garantira une fois allumé une zone de stérilité de 15 cm de rayon autour du bec ;  c’est dans cette zone que vous effectuerez toutes les manœuvres. Notons qu’il faut porter des habits anciens ou une blouse afin de ne pas se salir avec l’eau de javel.

Phase 2 :

  -    préparez les trois solutions dont nous avons déjà parlé. La première est le mouillant, elle est destinée à nettoyer les tissus et les graines - elle est composée de liquide vaisselle et d’eau bouillie. La seconde est destinée à la désinfection - la plus simple à préparer est celle qui est composée d’eau de javel : vous diluerez 5 fois un petit volume d’eau de javel avec de l’eau déminéralisée (le volume d’eau de javel prélevé aura été dilué une première fois comme il est préconisé sur l’emballage, concentration d’eau de Javel indicative :5%). Notons que les réussites avec ce type de désinfectant sont faibles. En fait, ceci fonctionne très bien avec des graines mais mal avec des boutures. Enfin la troisième solution est la solution de rinçage- elle n’est composée que d’eau bouillie(stérile).

Phase 3 :

Nous allons commencer avec les graines :

Placez ces dernières dans une petite soucoupe avec le mouillant pendant 3min puis retirez ce mouillant à l’aide de papier absorbant.

Versez dans la soucoupe le désinfectant, laissez agir 1-2min en fonction de la taille des graines.

Rincez ces graines après avoir absorbé le désinfectant.

A présent il ne vous reste plus qu’à mettre les graines en bouteilles.N’oubliez pas de travailler à coté de la flamme et de désinfecter souvent vos outils, les lames de métal pourront être plongées dans la flamme après chaque manœuvre.

Continuons par les boutures de feuilles :

Trempez les feuilles dans les trois solutions dont nous avons déjà parlé pendant une durée équivalente ou légèrement plus élevée (environ 4min).

Mettez les en bouteille face interne contre le substrat.

La durée de désinfection est variable ; elle dépend du produit utilisé. Certains nécessitent une durée supérieur à 20 mn. Certains cultivateurs utilisent de l’hypochlorite de calcium, des désinfectants pour biberons de bébés…

Résultats des courses :

Avec l’utilisation d’eau de javel, j’ai perdu presque 70% de mes cultures ( seules de bouteilles de boutures ont prises, c’étaient du pinguicula weiser et les crosses de binata). Par contre, toutes les graines ont prises : des Byblis liniflora et des Droseras capensis feuilles étroites et velues ont germé en moins d’une semaine et croissent très rapidement. De même le Drosera burmanii géant et le spatulata kansai ont germé en moins de deux semaines et ont entamé leur développement. Quelques temps plus tard du Biophytum a pris.

J’ai de grandes espérances pour le Byblis gigantea.

Deux de mes amis ont eu moins de chance que moi mais leurs expériences permettent de conclure que l’utilisation de fongicides à la place du désinfectant est absolument sans effet sur la moisissure. De plus l’hypochlorite de calcium, très souvent utilisé pour l’in vitro, ne garantit pas de meilleurs  résultats. Il serait intéressant d’essayer une série de désinfectants successifs pour éliminer la moisissure et les autres maladies, combiner se l’eau de javel avec de l’hypochlorite de calcium, essayer de l’eau oxygénée avec de l’alcool, mais il faut faire attention que ces produits ne détruisent pas les tissus.

Je pense que les échecs subis proviennent en grande partie d’un mauvais choix des tissus (récoltés sur des plantes en contact avec des moisissures) et surtout de l’utilisation d’un désinfectant peu efficace ou trop efficace (certaines de mes boutures ont confit dans la javel). Comme vous le constatez  la culture in vitro n’est pas simple pour l’amateur. Les laboratoires utilisent cette technique depuis plusieurs années avec succès, c’est pourquoi je pense que nous la maîtriserons biens dans les prochaines années(avec du matériel spécialisé )

Leçons retenues lors de ces expériences :

- mettre une seule feuille en bouteille réduit vos chances ; elle peut échapper à la moisissure mais nécroser par la suite ;

- placer plus que trois grandes feuilles dans un flacon est dangereux dans la mesure ou une seule feuille peut contracter des champignons, ces derniers se transmettant au reste des boutures en peu de temps.

- quand vous installerez des Droseras en bouteilles, veillez à ce que les feuilles soient dénuées de proies ; en fait, les proies sont de véritables foyers à moisissure, surtout en fin de saison, en automne ;

- les graines de drosophyllum semblent ne pas être destinées à la culture in vitro d’après Peter d’Amato.

- ne pas faire confire les tissus dans le désinfectant ;

- vous pouvez installer en bouteilles des graines appartenant à des pygmées en utilisant de la javel comme désinfectant,  entreprise difficile pour les raisons que nous avons déjà citées.

Coûts engendrés par ce type de culture :

- les milieux coûtent à peu près  5 euros pièce ;

- une vingtaine de bouteilles plus les bouchons : 40 euros (il est judicieux de collectionner des flacons à épices de type Ducros).

- comptez des frais supplémentaires pour le gaz et les désinfectants.

La sortie des plantes de bouteilles :

Les plantes issues de cultures in vitro sont très fragiles au début. Rien que le fait de les placer à une humidité inférieur à celle qu’elles connaissaient en bouteilles risqueraient de les dessécher. Il est conseillé de ne changer qu’un paramètre de culture à la fois (soit la température, soit l’éclairage…).

Sortez les plantes délicatement des bouteilles sans arracher les racines (la gélose adhère assez peu aux poils absorbants). Placez les plantes dans leur pots définitifs ou sur des terrines, dans les deux cas veillez à ce que le substrat soit bien humide. Notons qu’il est utile de placer les pots sous une plaque de verre ou de plastique pour augmenter l’hygrométrie. La reprise est assez lente et peut aller jusqu’à plusieurs semaines. Les boutures de Drosera binata ont bien prises par contre les Drosera burmanii sont morts quelques temps plus tard. Ceux- ci étaient de petite taille et sans doute pas viables. J’avais du les sortir de bouteilles car ils commençaient à jaunir, je pense que la gélose que j’avais achetée n’était pas de bonne qualité bien qu’elle fut spéciale Drosera. Notons aussi que les plantules portant de toutes petites racines ( inférieur à 2.5-3 mm) prennent avec beaucoup de difficultés. Les sensitives comme le biophytum peuvent être mises en bouteille, elles produisent peu voir pas de feuilles, seules les racines se développent ( de 1à 2 cm). Généralement ces petites plantes reprennent bien mieux que des plantules sans racines et avec peu de feuilles. De plus en plus les amateurs utilisent deux milieux successifs, un dit d’enracinement et un dit de multiplication. On place graines et boutures dans le milieu de multiplication puis au bout de quelques semaines dans le milieu d’enracinement. Cette méthode augmente sensiblement les chances de réussite.

Conclusion
Les pertes  rencontrées  dans les premiers tempsquand les plantes sont encore dans les bouteilles, précèdent une série d’autres pertes à la sortie des flacons. Si vous débutez comme moi dans cette technique, faites plusieurs essais sur des plantes ne vous tenant pas très à cœur vous limiterez ainsi les déceptions. Par contre, je suis certain qu’après quelques échecs vous pourrez reproduire à loisir vos plantes préférées.

Texte et photos: Lionel Léopoldès, toute reproduction interdite sans l'accord de l'auteur


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